Details

Øåëóäüêî Þ.Â.*, Ãåðàñèìåíêî È.Ì.*, Êàçàíöåâ À.À.*, Ñèíäàðîâñêàÿ ß.Ð.*, Ãîëäåíêîâà-Ïàâëîâà È.Â.**, Êó÷óê Í.Â*

Ââåäåíèå. Ãëàâíûì ïðåïÿòñòâèåì äëÿ áèîòåõíîëîãè÷åñêîãî ïðîèçâîäñòâà ðåêîìáèíàíòíûõ áåëêîâ â ðàñòåíèÿõ îáû÷íî ÿâëÿåòñÿ íèçêèé óðîâåíü íàêîïëåíèÿ öåëåâîãî ïðîäóêòà. Ýòî ìîæåò áûòü îáóñëîâëåíî ïîçèöèåé èíòåãðàöèè òðàíñãåíà, âëèÿíèåì íà ýêñïðåññèþ âíóòðèêëåòî÷íûõ ñèñòåì ðåãóëÿöèè, à òàêæå äåãðàäàöèåé ÷óæåðîäíûõ áåëêîâ. Äëÿ óëó÷øåíèÿ ñòàáèëüíîñòè è íàêîïëåíèÿ êîíå÷íîãî ïðîäóêòà íàìè áûëè ñîçäàíû ãåíåòè÷åñêèå êîíñòðóêöèè, â êîòîðûõ ê ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿì öåëåâûõ ãåíîâ áûëè äîáàâëåíû ñèãíàëüíûå òðàíñïîðòíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, à òàêæå îñóùåñòâëåíî òðàíñëÿöèîííîå ñëèÿíèå ñ ïîñëåäîâàòåëüíîñòüþ ðåïîðòåðíîãî áåëêà òåðìîñòàáèëüíîé ëèõåíàçû ñ îáðàçîâàíèåì ãèáðèäíîãî ãåíà. Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî èñïîëüçîâàíèå òàêîé ãèáðèäíîé ýêñïðåññèîííî-ðåïîðòåðíîé ñèñòåìû ïîçâîëèò îäíîâðåìåííî ñî ñòàáèëèçàöèåé öåëåâîãî ïðîäóêòà è ñîõðàíåíèåì åãî ôóíêöèîíàëüíîé àêòèâíîñòè ïðîâîäèòü ìîíèòîðèíã óðîâíÿ íàêîïëåíèÿ.

Ìàòåðèàëû è ìåòîäû. Äëÿ ìîëåêóëÿðíîãî êëîíèðîâàíèÿ èñïîëüçîâàëè ñòàíäàðòíûå ìåòîäû. Ïðîìåæóòî÷íîå êëîíèðîâàíèå îñóùåñòâëÿëè â âåêòîð pGEM-T easy (Promega, ÑØÀ).  ðàáîòå èñïîëüçîâàëè øòàìì Escherichia coli XL-1Blue è Agrobacterium tumefaciens GV3101. Òðàíçèåíòíóþ ýêñïðåññèþ êîíñòðóêöèé ïðîâîäèëè â ðàñòåíèÿõ Nicotiana excelsior êàê îïèñàíî ðàíåå (Sheludko et al., 2007). Àíàëèç àêòèâíîñòè GFP è òåðìîñòàáèëüíîé ëèõåíàçû â ýêñòðàêòàõ òêàíè ðàñòåíèé ïðîâîäèëè â ñîîòâåòñòâèè ñ îïèñàííûìè ïðîòîêîëàìè (Ãåðàñèìåíêî è äð., 2010).

Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå. Êîìïàðòìåíòàëèçàöèÿ ÷óæåðîäíûõ áåëêîâ ïîçâîëÿåò çíà÷èòåëüíî óâåëè÷èòü óðîâåíü èõ íàêîïëåíèÿ â ðàñòèòåëüíîé êëåòêå (âåðîÿòíî, âñëåäñòâèè óìåíüøåíèÿ ïðîòåàçíîãî ãèäðîëèçà) èëè îïðåäåëÿåò ñîîòâåòñòâóþùóþ ôóíêöèîíàëüíóþ àêòèâíîñòü. Íàìè áûëè ñîçäàíû ãåíåòè÷åñêèå âåêòîðà, ñîäåðæàùèå ïîñëåäîâàòåëüíîñòü çðåëîãî èíòåðôåðîíà àëüôà 2b ÷åëîâåêà (ÈÔÍ) ñ ñèãíàëüíûì ïåïòèäîì ðàñòèòåëüíîãî áåëêà-øàïåðîíà êàëüðåòèêóëèíà, ëîêàëèçîâàííîãî â ÝÐ, è ãèáðèäíîãî ãåíà àöèë-ëèïèäíîé äåñàòóðàçû ñ ñèãíàëîì õëîðîïëàñòíîãî òðàíñïîðòà ìàëîé ñóáúåäèíèöû ÐÓÁÈÑÊÎ àðàáèäîïñèñà. Àíàëèç ýêñïðåññèè ïîêàçàë, ÷òî àêòèâíîñòü ÈÔÍ ñ ðàñòèòåëüíûì òðàíñïîðòíûì ñèãíàëîì íà ïîðÿäîê ïðåâûøàëà ñîîòâåòñòâóþùåå çíà÷åíèå äëÿ ÈÔÍ ñ íàòèâíûì ëèäåðíûì ïåïòèäîì.

Äëÿ ñîçäàíèÿ ãèáðèäíûõ ãåíîâ ÈÔÍ, ñîìàòîòðîïíîãî ãîðìîíà ÷åëîâåêà è GFP ïîëó÷åííûå â ðåçóëüòàòå ÏÖÐ ôðàãìåíòû ÄÍÊ áûëè êëîíèðîâàíû â âåêòîð pGEM-T easy ñ ïîñëåäóþùèì ëèãèðîâàíèåì c ïîñëåäîâàòåëüíîñòüþ ãåíà òåðìîñòàáèëüíîé ëèõåíàçû Clostridium thermocellum licBÌ3. Îáðàçîâàâøèåñÿ ãèáðèäíûå ãåíû áûëè ïîìåùåíû ïîä êîíòðîëü ïðîìîòîðà 35S ÐÍÊ ÂÌÖÊ. Ëèõåíàçíàÿ àêòèâíîñòü áûëà îáíàðóæåíà âî âñåõ ýêñòðàêòàõ òêàíè N. excelsior ïîñëå èíôèëüòðàöèè àãðîáàêòåðèÿìè, ñîäåðæàùèìè ñîçäàííûå âåêòîðà. SDS-PAGE ýêñòðàêòîâ íàòèâíîãî è ãèáðèäíîãî GFP, ïîëó÷åííûõ ïîñëå òðàíçèåíòíîé ýêñïðåññèè â N. excelsior, ïîêàçàë íàëè÷èå ôëóîðåñöåíöèè ãèáðèäíîãî áåëêà è îòñóòñòâèå äåòåêòèðóåìûõ ïðîäóêòîâ åãî ãèäðîëèçà.

Âûâîäû. Ñîçäàíà ñåðèÿ ãåíåòè÷åñêèõ êîíñòðóêöèé äëÿ ýôôåêòèâíîé ýêñïðåññèè è äåòåêöèè ðåêîìáèíàíòíûõ áåëêîâ â ðàñòåíèÿõ.

Ðàáîòà ïîääåðæàíà ãðàíòàìè ÍÀÍ Óêðàèíû, íîìåð ãîñ. ðåã. ÓÍÒÖ 0110U006061 è 0110U006062.