• Print
Details
Шелудько Ю.В.*, Герасименко И.М.*, Казанцев А.А.*, Синдаровская Я.Р.*, Голденкова-Павлова И.В.**, Кучук Н.В*
*Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины
ул. Академика Заболотного, 148, г. Киев, 03680, Украина; E-mail: This e-mail address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.
**Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
ул. Губкина, 3, г. Москва, 119991, Россия

 

Введение. Главным препятствием для биотехнологического производства рекомбинантных белков в растениях обычно является низкий уровень накопления целевого продукта. Это может быть обусловлено позицией интеграции трансгена, влиянием на экспрессию внутриклеточных систем регуляции, а также деградацией чужеродных белков. Для улучшения стабильности и накопления конечного продукта нами были созданы генетические конструкции, в которых к последовательностям целевых генов были добавлены сигнальные транспортные последовательности, а также осуществлено трансляционное слияние с последовательностью репортерного белка термостабильной лихеназы с образованием гибридного гена. Предполагается, что использование такой гибридной экспрессионно-репортерной системы позволит одновременно со стабилизацией целевого продукта и сохранением его функциональной активности проводить мониторинг уровня накопления.

Материалы и методы. Для молекулярного клонирования использовали стандартные методы. Промежуточное клонирование осуществляли в вектор pGEM-T easy (Promega, США). В работе использовали штамм Escherichia coli XL-1Blue и Agrobacterium tumefaciens GV3101. Транзиентную экспрессию конструкций проводили в растениях Nicotiana excelsior как описано ранее (Sheludko et al., 2007). Анализ активности GFP и термостабильной лихеназы в экстрактах ткани растений проводили в соответствии с описанными протоколами (Герасименко и др., 2010).

Результаты и обсуждение. Компартментализация чужеродных белков позволяет значительно увеличить уровень их накопления в растительной клетке (вероятно, вследствии уменьшения протеазного гидролиза) или определяет соответствующую функциональную активность. Нами были созданы генетические вектора, содержащие последовательность зрелого интерферона альфа 2b человека (ИФН) с сигнальным пептидом растительного белка-шаперона кальретикулина, локализованного в ЭР, и гибридного гена ацил-липидной десатуразы с сигналом хлоропластного транспорта малой субъединицы РУБИСКО арабидопсиса. Анализ экспрессии показал, что активность ИФН с растительным транспортным сигналом на порядок превышала соответствующее значение для ИФН с нативным лидерным пептидом.

Для создания гибридных генов ИФН, соматотропного гормона человека и GFP полученные в результате ПЦР фрагменты ДНК были клонированы в вектор pGEM-T easy с последующим лигированием c последовательностью гена термостабильной лихеназы Clostridium thermocellum licBМ3. Образовавшиеся гибридные гены были помещены под контроль промотора 35S РНК ВМЦК. Лихеназная активность была обнаружена во всех экстрактах ткани N. excelsior после инфильтрации агробактериями, содержащими созданные вектора. SDS-PAGE экстрактов нативного и гибридного GFP, полученных после транзиентной экспрессии в N. excelsior, показал наличие флуоресценции гибридного белка и отсутствие детектируемых продуктов его гидролиза.

Выводы. Создана серия генетических конструкций для эффективной экспрессии и детекции рекомбинантных белков в растениях.

Работа поддержана грантами НАН Украины, номер гос. рег. УНТЦ 0110U006061 и 0110U006062.