Details

Òèõîíîâè÷ È.À., Îñèïîâà Ì.À., Ëóòîâà Ë.À., Äîëãèõ Å.À.

Âñåðîññèéñêèé íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé èíñòèòóò ñåëüñêîõîçÿéñòâåííîé ìèêðîáèîëîãèè
Ñàíêò-Ïåòåðáóðã, Ïóøêèí, øîññå Ïîäáåëüñêîãî, 3, 196608; E-mail: This e-mail address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

Ââåäåíèå. Ïðè ñèìáèîçå áîáîâûõ ðàñòåíèé ñ ïî÷âåííûìè áàêòåðèÿìè ñåìåéñòâà Rhizobiaceae íà êîðíÿõ ðàñòåíèé ôîðìèðóþòñÿ íîâûå îðãàíû – ñèìáèîòè÷åñêèå êëóáåíüêè, â êîòîðûõ áàêòåðèè îñóùåñòâëÿþò ïðîöåññ áèîëîãè÷åñêîé ôèêñàöèè ìîëåêóëÿðíîãî àçîòà. Êëóáåíüêîîáðàçîâàíèå – ñòðîãî êîíòðîëèðóåìûé ïðîöåññ, îñíîâàííûé íà ïîääåðæàíèè áàëàíñà ìåæäó èíòåíñèâíîñòüþ àçîòôèêñàöèè è ñíàáæåíèåì ïèòàòåëüíûìè âåùåñòâàìè ýòèõ îðãàíîâ. Âàæíûì ìåõàíèçìîì òàêîãî êîíòðîëÿ ÿâëÿåòñÿ ñèñòåìíàÿ ðåãóëÿöèÿ (àâòîðåãóëÿöèÿ êëóáåíüêîîáðàçîâàíèÿ), îñíîâàííàÿ íà îáìåíå ñèãíàëàìè ìåæäó ïîáåãîì è êîðíåì ðàñòåíèÿ. Îäíàêî ìåõàíèçìû äåéñòâèÿ è ïðèðîäà ñèãíàëîâ, âîâëå÷åííûõ â ñèñòåìó àâòîðåãóëÿöèè, îñòàþòñÿ äàëåêèìè îò ïîíèìàíèÿ. Îòíîñèòåëüíî íåäàâíî áûëî ïîêàçàíî, ÷òî â ñèñòåìíóþ ðåãóëÿöèþ êëóáåíüêîîáðàçîâàíèÿ ìîãóò áûòü âîâëå÷åíû êîìïîíåíòû êîìïëåêñà CLAVATA – ãåòåðîäèìåðíûé ðåöåïòîðíûé êîìïëåêñ, ñôîðìèðîâàííûé ðåöåïòîðíûìè êèíàçàìè CLAVATA1 (CLV1) è CLAVATA2 (CLV2), ëèãàíäîì êîòîðîãî ÿâëÿåòñÿ ïåïòèäíûé ðåãóëÿòîð CLE-ñåìåéñòâà (CLV3). Èçó÷åíèþ îñîáåííîñòåé ôóíêöèîíèðîâàíèÿ CLAVATA êîìïëåêñà â ñèñòåìíîé ðåãóëÿöèè êëóáåíüêîîáðàçîâàíèÿ è áûëà ïîñâÿùåíà âûïîëíåííàÿ ðàáîòà.

Ìàòåðèàëû è ìåòîäû. Äëÿ ñîçäàíèÿ ãåíåòè÷åñêèõ êîíñòðóêöèé, ñîäåðæàùèõ ïðîìîòîð èçó÷àåìîãî ãåíà, ñîåäèíåííûé ñ ãåíîì-ðåïîðòåðîì èñïîëüçîâàëè ñèñòåìó âåêòîðîâ äëÿ ýôôåêòèâíîãî êëîíèðîâàíèÿ (Invitrogen). Ïðîìîòîð àìïëèôèöèðîâàëè íà ìàòðèöå ãåíîìíîé ÄÍÊ îáúåêòà ñ èñïîëüçîâàíèåì âûñîêîòî÷íîé ïîëèìåðàçû Pfu, ïîëó÷åííûå ôðàãìåíòû êëîíèðîâàëè â âåêòîðå pENTR/D-TOPO. Ïîñëå ïîäòâåðæäåíèÿ ïðàâèëüíîñòè âñòàâêè ïðîìîòîðà â âåêòîð, îñóùåñòâëÿëè ïåðåêëîíèðîâàíèå ïðîìîòîðà â âåêòîð äîñòàâêè pBGWFS7, ñîäåðæàùèé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ðåïîðòåðíûõ ãåíîâ GFP/GUS è òåðìèíàòîðà 35S. Øòàììîì Agrobacterium rhizogenes, íåñóùèì ãåíåòè÷åñêèå êîíñòðóêöèè, òðàíñôîðìèðîâàëè ðàñòåíèÿ ëþöåðíû Medicago truncatula è ãîðîõà Pisum sativum.

Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå. Èçâåñòíî, ÷òî ðåöåïòîðíûé êîìïëåêñ CLAVATA âîâëå÷åí â ðåãóëÿöèþ ïðîëèôåðàöèè êëåòîê ïðè ðàçâèòèè ðåãóëÿðíûõ ìåðèñòåì ðàñòåíèÿ.  àïèêàëüíîé ìåðèñòåìå ïîáåãà ñâÿçûâàíèå ðåãóëÿòîðíîãî ïåïòèäà CLV3 ñ ðåöåïòîðíûì êîìïëåêñîì CLV1/CLV2 àêòèâèðóåò ñèãíàëüíûé êàñêàä, ïîäàâëÿþùèé ýêñïðåññèþ ãîìåîäîìåí-ñîäåðæàùåãî òðàíñêðèïöèîííîãî ôàêòîðà ñåìåéñòâà WOX - WUSHEL (WUS). WUS ýêñïðåññèðóåòñÿ â ìåðèñòåìå ïîáåãà (â îðãàíèçóþùåì öåíòðå) è îòâå÷àåò çà ïîääåðæàíèå êëåòî÷íûõ äåëåíèé è ïîäàâëåíèå äèôôåðåíöèðîâêè ïðèëåæàùèõ êëåòîê. Ãîìîëîãè÷íûé ãåí WOX5 ýêñïðåññèðóåòñÿ â ïîêîÿùåìñÿ öåíòðå ìåðèñòåìû êîðíÿ è îòâå÷àåò çà ïîääåðæàíèå êëåòî÷íûõ äåëåíèé è ïîäàâëåíèå äèôôåðåíöèðîâêè ïðèëåæàùèõ êëåòîê-èíèöèàëåé (ñòâîëîâûõ êëåòîê). Êàê ïîêàçàëè èññëåäîâàíèÿ íà ìîäåëüíîì îáúåêòå, àðàáèäîïñèñå, ïðîäóêòû ãåíîâ WUS è WOX5 ôóíêöèîíàëüíî ýêâèâàëåíòíû. Òàêèì îáðàçîì, ñèñòåìû WUS-CLAVATA è WOX5-CLAVATA ôóíêöèîíèðóþò â «îðãàíèçóþùèõ öåíòðàõ» ìåðèñòåì è îáåñïå÷èâàþò ïîääåðæàíèå ïóëà ñòâîëîâûõ êëåòîê, ñòèìóëèðóÿ èõ ïðîëèôåðàöèþ è áëîêèðóÿ äèôôåðåíöèðîâêó.  îñíîâå îðãàíîãåíåçà êëóáåíüêîâ áîáîâûõ ðàñòåíèé ëåæèò ðåàêòèâàöèÿ äåëåíèé êëåòîê êîðû êîðíÿ è ïåðèöèêëà è ôîðìèðîâàíèå ïðèìîðäèÿ/ìåðèñòåìû êëóáåíüêà. Êàê ïîêàçàë àíàëèç ìóòàíòîâ, â ñèñòåìíûé êîíòðîëü ýòîãî ïðîöåññà âîâëå÷åíû êîìïîíåíòû CLV-ïîäîáíîé ñèñòåìû (CLV1 è ÑLV2). Êðîìå òîãî, áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ãåí WOX5 gene ýêñïðåññèðóåòñÿ â ìåðèñòåìå êëóáåíüêîâ M. truncatula, îäíàêî åãî ôóíêöèÿ íå áûëà èññëåäîâàíà.  íàøèõ èññëåäîâàíèÿõ áûëà äåòàëüíî èçó÷åíà ðîëü ãåíà WOX5 è åãî âçàèìîäåéñòâèå ñ CLV-ïîäîáíîé ñèñòåìîé ïðè ðàçâèòèè êëóáåíüêîâ ó äâóõ áîáîâûõ ðàñòåíèé: M. truncatula è P. sativum. Àíàëèç äèíàìèêè ýêñïðåññèè WOX5 è ëîêàëèçàöèÿ áûëè èçó÷åíû ìåòîäîì êîëè÷åñòâåííîãî ÎÒ-ÏÖÐ, à òàêæå ñ ïîìîùüþ ðåïîðòåðíîé êîíñòðóêöèè pWOX5::GUS ïðè ðàçâèòèè êëóáåíüêîâ. Óñòàíîâëåíî, ÷òî ýêñïðåññèÿ WOX5 âîçðàñòàåò ïîñëå èíîêóëÿöèè è îñòàåòñÿ âûñîêîé â ðàçâèâàþùèõñÿ ïðèìîðäèÿõ êëóáåíüêîâ, ÷òî ñâèäåòåëüñòâóåò î âàæíîé ðîëè WOX5 â îðãàíîãåíåçå ýòèõ îðãàíîâ. Êàê ïîêàçàëè íàøè èññëåäîâàíèÿ, óðîâåíü è îáëàñòü ýêñïðåññèè ãåíà WOX5 áûëà çíà÷èòåëüíî ïîâûøåíà ó ñóïåðêëóáåíüêîîáðàçóþùèõ ìóòàíòîâ ñ íàðóøåíèåì ñèñòåìû àâòîðåãóëÿöèè êëóáåíüêîîáðàçîâàíèÿ, äåôåêòíûõ ïî ãåíàì CLV1 è CLV2. Òàêèì îáðàçîì, â íàøèõ èññëåäîâàíèÿõ áûëè ïîëó÷åíû äàííûå îá ó÷àñòèè CLV-WOX5 ðåãóëÿòîðíîãî ïóòè ïðè ðàçâèòèè êëóáåíüêîâ ó áîáîâûõ ðàñòåíèé è åãî êîíñåðâàòèâíîé ôóíêöèè â ðåãóëÿðíûõ è íåðåãóëÿðíûõ ìåðèñòåìàõ ðàñòåíèé.

Âûâîäû. Ñ èñïîëüçîâàíèåì áèîòåõíîëîãè÷åñêîãî ïîäõîäà áûëè âûïîëíåíû èññëåäîâàíèÿ, íàïðàâëåííûå íà èçó÷åíèå ðåãóëÿòîðîâ, âîâëå÷åííûõ â ñèñòåìíûé êîíòðîëü êëóáåíüêîîáðàçîâàíèÿ ó áîáîâûõ ðàñòåíèé.

Ðàáîòà áûëà ïîääåðæàíà ãðàíòîì ÐÔÔÈ ¹ 11-04-01689-à.