• Print
Details
Синдаровская Я.Р., Герасименко И.М., Головач И.С., Шелудько Ю.В., Кучук Н.В.
Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины
Украина, 03680, г. Киев, ул. Академика Заболотного, 148. E-mail: This e-mail address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

Введение. Транзиентная экспрессия генов - эффективный биотехнологический подход для первичного отбора векторных конструкций и быстрой проверки функциональной активности целевых белков в лабораторных условиях. Помимо этого, данный метод может быть использован для препаративного накопления рекомбинантных белков. Нами был проведен подбор условий и выполнен скрининг видов, обеспечивающих максимальную продукцию целевых белков в растениях методом транзиентной экспрессии in planta и in vitro.

Материалы и методы. В работе были использованы гены репортерных белков GFP и бета-глюкуронидазы. Транзиентную экспрессию проводили методом агроинфильтрации суспензии Agrobacterium tumefaciens GV3101 в мезофильную ткань листа или путём кокультивирования каллусной ткани с агробактерией в течение 4 суток. Наличие целевых белков определяли специфичными методами. Общее содержание белка определяли методом Бредфорда.

Результаты и обсуждение. Был проведен подбор условий для повышения продукции целевых белков в растениях. Наилучший результат был продемонстрирован для 3-4 верхних листьев молодых растений без бутонов. Введение вирусного супрессора сайленсинга генов увеличивало содержание целевого белка для разных типов экспрессионных систем. Показано, что уровень транзиентной экспрессии может сильно варьировать в зависимости от вида растения-хозяина. В ходе работы были протестированы австралийские виды рода Nicotiana и найдены новые виды-продуценты целевых белков – Nicotiana excelsior и N. cavicola, имеющие ряд преимуществ по сравнению с модельным видом-продуцентом N. benthamiana. Растения N. excelsior имеют большую биомассу и скорость роста в условиях теплицы, а уровень транзиентной экспрессии и накопления целевых белков в этом виде не уступает такому в N. benthamiana. Растения N. cavicola имеют более высокое, чем N. benthamiana, содержание целевых белков при схожем значении биомассы. Данные виды могут быть предложены в качестве альтернативных при тестировании генетических конструкций методом транзиентной экспрессии в лабораторных условиях, а также как возможные кандидаты для препаративного получении целевых белков методом транзиентной экспрессии. С помощью транзиентной экспрессии в новых видах-продуцентах было показано накопление ряда целевых белков (в том числе фармацевтических) и показана их функциональная активность.

Нами был разработан протокол для быстрой оценки уровня транзиентной экспрес­сии репортерного гена GUS в культурах недифференцированных клеток. Данная система позволяет получать белки в строго контролируемых условиях, что важно для промышленных процессов. Был проведен первичный скрининг каллусных культур приблизительно 300 видов растений из 49 семейств, и отобрано 20 наиболее перспективных видов-продуцентов целевых белков, принадлежащих преимущественно к семействам Solanaceae, Compositae и Malvaceae.

Выводы. Подбор оптимальных условий, поиск новых перспективных видов-продуцентов, а также создание новых систем для получения целевых белков являются важными факторами для эффективного использования транзиентной экспрессии в биотехнологии.