Èíñòèòóò êëåòî÷íîé áèîëîãèè è ãåíåòè÷åñêîé èíæåíåðèè ÍÀÍ Óêðàèíû
Óêðàèíà, 03680, ã. Êèåâ, óë. Àêàäåìèêà Çàáîëîòíîãî, 148. E-mail: This e-mail address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

Ââåäåíèå. Òðàíçèåíòíàÿ ýêñïðåññèÿ ãåíîâ - ýôôåêòèâíûé áèîòåõíîëîãè÷åñêèé ïîäõîä äëÿ ïåðâè÷íîãî îòáîðà âåêòîðíûõ êîíñòðóêöèé è áûñòðîé ïðîâåðêè ôóíêöèîíàëüíîé àêòèâíîñòè öåëåâûõ áåëêîâ â ëàáîðàòîðíûõ óñëîâèÿõ. Ïîìèìî ýòîãî, äàííûé ìåòîä ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí äëÿ ïðåïàðàòèâíîãî íàêîïëåíèÿ ðåêîìáèíàíòíûõ áåëêîâ. Íàìè áûë ïðîâåäåí ïîäáîð óñëîâèé è âûïîëíåí ñêðèíèíã âèäîâ, îáåñïå÷èâàþùèõ ìàêñèìàëüíóþ ïðîäóêöèþ öåëåâûõ áåëêîâ â ðàñòåíèÿõ ìåòîäîì òðàíçèåíòíîé ýêñïðåññèè in planta è in vitro.

Ìàòåðèàëû è ìåòîäû.  ðàáîòå áûëè èñïîëüçîâàíû ãåíû ðåïîðòåðíûõ áåëêîâ GFP è áåòà-ãëþêóðîíèäàçû. Òðàíçèåíòíóþ ýêñïðåññèþ ïðîâîäèëè ìåòîäîì àãðîèíôèëüòðàöèè ñóñïåíçèè Agrobacterium tumefaciens GV3101 â ìåçîôèëüíóþ òêàíü ëèñòà èëè ïóò¸ì êîêóëüòèâèðîâàíèÿ êàëëóñíîé òêàíè ñ àãðîáàêòåðèåé â òå÷åíèå 4 ñóòîê. Íàëè÷èå öåëåâûõ áåëêîâ îïðåäåëÿëè ñïåöèôè÷íûìè ìåòîäàìè. Îáùåå ñîäåðæàíèå áåëêà îïðåäåëÿëè ìåòîäîì Áðåäôîðäà.

Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå. Áûë ïðîâåäåí ïîäáîð óñëîâèé äëÿ ïîâûøåíèÿ ïðîäóêöèè öåëåâûõ áåëêîâ â ðàñòåíèÿõ. Íàèëó÷øèé ðåçóëüòàò áûë ïðîäåìîíñòðèðîâàí äëÿ 3-4 âåðõíèõ ëèñòüåâ ìîëîäûõ ðàñòåíèé áåç áóòîíîâ. Ââåäåíèå âèðóñíîãî ñóïðåññîðà ñàéëåíñèíãà ãåíîâ óâåëè÷èâàëî ñîäåðæàíèå öåëåâîãî áåëêà äëÿ ðàçíûõ òèïîâ ýêñïðåññèîííûõ ñèñòåì. Ïîêàçàíî, ÷òî óðîâåíü òðàíçèåíòíîé ýêñïðåññèè ìîæåò ñèëüíî âàðüèðîâàòü â çàâèñèìîñòè îò âèäà ðàñòåíèÿ-õîçÿèíà.  õîäå ðàáîòû áûëè ïðîòåñòèðîâàíû àâñòðàëèéñêèå âèäû ðîäà Nicotiana è íàéäåíû íîâûå âèäû-ïðîäóöåíòû öåëåâûõ áåëêîâ – Nicotiana excelsior è N. cavicola, èìåþùèå ðÿä ïðåèìóùåñòâ ïî ñðàâíåíèþ ñ ìîäåëüíûì âèäîì-ïðîäóöåíòîì N. benthamiana. Ðàñòåíèÿ N. excelsior èìåþò áîëüøóþ áèîìàññó è ñêîðîñòü ðîñòà â óñëîâèÿõ òåïëèöû, à óðîâåíü òðàíçèåíòíîé ýêñïðåññèè è íàêîïëåíèÿ öåëåâûõ áåëêîâ â ýòîì âèäå íå óñòóïàåò òàêîìó â N. benthamiana. Ðàñòåíèÿ N. cavicola èìåþò áîëåå âûñîêîå, ÷åì N. benthamiana, ñîäåðæàíèå öåëåâûõ áåëêîâ ïðè ñõîæåì çíà÷åíèè áèîìàññû. Äàííûå âèäû ìîãóò áûòü ïðåäëîæåíû â êà÷åñòâå àëüòåðíàòèâíûõ ïðè òåñòèðîâàíèè ãåíåòè÷åñêèõ êîíñòðóêöèé ìåòîäîì òðàíçèåíòíîé ýêñïðåññèè â ëàáîðàòîðíûõ óñëîâèÿõ, à òàêæå êàê âîçìîæíûå êàíäèäàòû äëÿ ïðåïàðàòèâíîãî ïîëó÷åíèè öåëåâûõ áåëêîâ ìåòîäîì òðàíçèåíòíîé ýêñïðåññèè. Ñ ïîìîùüþ òðàíçèåíòíîé ýêñïðåññèè â íîâûõ âèäàõ-ïðîäóöåíòàõ áûëî ïîêàçàíî íàêîïëåíèå ðÿäà öåëåâûõ áåëêîâ (â òîì ÷èñëå ôàðìàöåâòè÷åñêèõ) è ïîêàçàíà èõ ôóíêöèîíàëüíàÿ àêòèâíîñòü.

Íàìè áûë ðàçðàáîòàí ïðîòîêîë äëÿ áûñòðîé îöåíêè óðîâíÿ òðàíçèåíòíîé ýêñïðåñ­ñèè ðåïîðòåðíîãî ãåíà GUS â êóëüòóðàõ íåäèôôåðåíöèðîâàííûõ êëåòîê. Äàííàÿ ñèñòåìà ïîçâîëÿåò ïîëó÷àòü áåëêè â ñòðîãî êîíòðîëèðóåìûõ óñëîâèÿõ, ÷òî âàæíî äëÿ ïðîìûøëåííûõ ïðîöåññîâ. Áûë ïðîâåäåí ïåðâè÷íûé ñêðèíèíã êàëëóñíûõ êóëüòóð ïðèáëèçèòåëüíî 300 âèäîâ ðàñòåíèé èç 49 ñåìåéñòâ, è îòîáðàíî 20 íàèáîëåå ïåðñïåêòèâíûõ âèäîâ-ïðîäóöåíòîâ öåëåâûõ áåëêîâ, ïðèíàäëåæàùèõ ïðåèìóùåñòâåííî ê ñåìåéñòâàì Solanaceae, Compositae è Malvaceae.

Âûâîäû. Ïîäáîð îïòèìàëüíûõ óñëîâèé, ïîèñê íîâûõ ïåðñïåêòèâíûõ âèäîâ-ïðîäóöåíòîâ, à òàêæå ñîçäàíèå íîâûõ ñèñòåì äëÿ ïîëó÷åíèÿ öåëåâûõ áåëêîâ ÿâëÿþòñÿ âàæíûìè ôàêòîðàìè äëÿ ýôôåêòèâíîãî èñïîëüçîâàíèÿ òðàíçèåíòíîé ýêñïðåññèè â áèîòåõíîëîãèè.